海藻糖含量試劑盒說(shuō)明書(shū) 分光光度法 50 管/48 樣 正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定 測(cè)定意義： 海藻糖廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。由于海藻糖具有*的不同于其他碳 水化合物的生物學(xué)特性，能在干旱、高溫、脫水、冷凍、高滲透壓及毒性物質(zhì)等惡劣環(huán)境下 保護(hù)生物體細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、核酸等組分不受損害。 測(cè)定原理： 蒽酮比色法。具有靈敏度高﹑簡(jiǎn)便快捷﹑適用于微量樣品的測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。 需自備的儀器和用品： 可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿﹑研缽、濃硫酸（不允許快遞） 和蒸餾水。 試劑的組成和配制： 提取液：液體 50ml×1 瓶，4℃保存； 試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存； 海藻糖提?。? 1、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù) 30 次），室 溫靜置 45min，振蕩 3~5 次，冷卻后，8000g，25℃離心 10min，取上清。 2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），冰浴勻漿，室溫靜置 45min，振蕩 3~5 次，冷卻后，8000g，25℃ 離心 10min，取上清。 3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建 議取 0.1mL 血清（漿）加入 1mL 提取液），冰浴勻漿，室溫靜置 45min，振蕩 3~5 次，冷卻 后，8000g，25℃離心 10min，取上清。 測(cè)定步驟： 1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 620nm，蒸餾水調(diào)零。 2、 調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。 3、工作液的配制：臨用前在試劑一中加入 7.5mL 蒸餾水后，緩慢加入 42.5mL 濃硫酸，不 斷攪拌，充分溶解，待用；用不完的試劑 4℃保存一周； 4、樣本測(cè)定：取 0.25mL 樣本和 1mL 工作液至 EP 管中，95 度水浴 10 min（蓋緊，防止水 分散失），自然冷卻至室溫，在 620 nm 波長(zhǎng)下記錄測(cè)定吸光度值 A。 注意：由于工作液具有強(qiáng)腐蝕性，請(qǐng)謹(jǐn)慎操作。 若吸光值大于1，請(qǐng)將樣本用提取液稀釋后再測(cè)定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。海藻糖含量計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 8.8976x+0.0729；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y 為吸光值。 2、按樣本鮮重計(jì)算： 海藻糖含量(mg/g 鮮重)= [V1×(A -0.0729)÷8.8976]÷(W×V1÷V2)=0.112×(A -0.0729) ÷W。 3、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 海藻糖含量(mg/mg prot)=[ V1×(A -0.0729) ÷8.8976]÷(V1×Cpr)=0.112×(A -0.0729) ÷Cpr。 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 海藻糖含量(μg/104 cell)=[1000×V1×(A -0.0729) ÷8.8976]÷(500×V1÷V2)=0.224×(A -0.0729) 5、血清（漿）海藻糖含量計(jì)算 海藻糖含量（mg/mL）＝[V1×(A -0.0729）÷8.8976 )]÷(V3×V1÷V2)=1.12×(A -0.0729) 1000：1mg/mL=1000µg/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25 mL；V2：加入提取液總 體積 1mL；V3：加入血清（漿體積），0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì) 量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。 注意：zui低檢測(cè)限為 10μg/g 鮮重或 0.1μg/ mg prot | 
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