PCR法支原體檢測試劑盒*了，歡迎大家！南京信帆生物代理銷售PCR法支原體檢測試劑盒，現(xiàn)貨供應(yīng)，歡迎大家！
《PCR法支原體檢測試劑盒》
儲存條件
該產(chǎn)品在常溫下運輸，收到產(chǎn)品后，請立即放-20 ℃冰箱低溫保存。該條件下，至少2年內(nèi)有效。
產(chǎn)品用途
《PCR法支原體檢測試劑盒》可用于檢測一切可能含支原體的樣品，比如：（1）體外細胞培養(yǎng)的上清；（2）血清；（3）各種體液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；（4）別的液體樣品。本產(chǎn)品僅供研究使用。
產(chǎn)品簡介
哺乳動物細胞的培養(yǎng)，支原體（Mycoplasma）污染是個世界性的問題。支原體污染幾乎可以改變細胞的所有參數(shù)，導(dǎo)致實驗結(jié)果的不準確、甚至*錯誤。從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養(yǎng)都要進行支原體檢測。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。
培養(yǎng)法是相對可靠的支原體檢測技術(shù)，但是該方法非常耗時的，需要數(shù)周，不適合作為細胞培養(yǎng)液中支原體污染的快速檢測。此外，通過固體培養(yǎng)法無法檢測污染細胞的一種zui常見的支原體，即豬鼻支原體（M.Hyorhinis）。這是因為豬鼻支原體無法在支原體固體培養(yǎng)基上形成可見的菌落。而豬鼻支原體約占所有支原體污染的20-50%。
有的實驗室使用熒光染色法檢測支原體，但是該方法靈敏度太低，當檢測成陽性時，細胞經(jīng)常已經(jīng)嚴重污染。
目前，細胞培養(yǎng)液中支原體污染的檢測通常使用的是PCR法。但是PCR法也有明顯的缺點：（1）整個過程大約需要3個小時；（2）由于細胞培養(yǎng)數(shù)天后，培養(yǎng)液中經(jīng)常含有嚴重抑制PCR擴增的代謝物，所以樣品的前處理一般是PCR法*的環(huán)節(jié)；（3）PCR法的靈敏度有限，通常需要將培養(yǎng)液離心濃縮或者抽提DNA后再檢測；（4）PCR產(chǎn)物的電泳，需要用到EB等潛在的致癌物質(zhì)；（5）需要用到PCR儀、電泳槽、凝膠成像儀、離心機等儀器。
PCR法支原體檢測試劑盒*了，歡迎大家
本公司已經(jīng)開發(fā)出了于體外細胞培養(yǎng)的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》，與PCR法支原體檢測相比，其具有許多優(yōu)點：耗時短、靈敏度高、操作簡單、不會被細胞代謝產(chǎn)物抑制、結(jié)果無需電泳肉眼可直接判斷等。
盡管如此，《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》可能也有個小缺點：因為《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》需要至少同時使用4條引物才能完成擴增，其引物設(shè)計相對困難。雖然經(jīng)我們測試，該試劑盒至少可認識其說明書中列舉的13種支原體，而這13種支原體大約占污染細胞的支原體種類的99%左右。但是，不排除《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》無法識別個別在體外細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)概率極低的支原體。為此，我們特意開發(fā)了具有廣譜識別能力的《PCR法支原體檢測試劑盒》作為補充。此外，單獨使用目前市面上的任何一種支原體檢測試劑盒，都無法做到正確，既不會漏檢（假陰性），也不會多檢（假陽性）。嚴格的支原體檢測，至少需要使用兩種，做好使用三種不同原理的支原體檢測方法同時進行檢測，才能使檢測結(jié)果接近正確。
如果您想得到正確的支原體檢測結(jié)果，同時使用本公司生物試劑的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》和《PCR法支原體檢測試劑盒》進行檢測，將會得到比較滿意的結(jié)果。
試劑盒組成
檢測過程:
為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養(yǎng)液樣品來源于至少培養(yǎng)3天且匯合度在70-90%左右的細胞培養(yǎng)液上清（貼壁細胞）。懸浮培養(yǎng)的細胞也需要在換液傳代后，至少讓細胞生長3天再取培養(yǎng)液進行檢測。取150 μL上述待測樣品，在普通臺式離心機上1200 rpm (大約150-200 g)離心5 min，取離心后的上清100 μL用于支原體檢測，丟棄下層剩余的50 μL（含細胞沉淀）。收集并已經(jīng)離心去除細胞的待測樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個月，在-80℃基本可以保存。
請按下表（表1）進行PCR體系（總體積25 μL）的配制:
表1.PCR擴增體系的配制
| Negative Control | Positive Control | Sample |
去離子水 | 17.5 μL | 15.5 μL | 15.5 μL |
10×Taq DNA 聚合酶緩沖液(含Mg2+) | 2.5 μL | 2.5 μL | 2.5 μL |
2.5 mM dNTP | 2.5 μL | 2.5 μL | 2.5 μL |
5 Units/μL Taq DNA 聚合酶 | 0.5 μL | 0.5 μL | 0.5 μL |
支原體引物和內(nèi)參 | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
陽性支原體DNA或待測樣品 | - | 2 μL | 2 μL |
1 cycle 94 ℃ for 2 minutes
35 cylses 94 ℃ for 20 seconds
55 ℃ for 20 seconds
72 ℃ for 45 seconds
1 cycle 72 ℃ for 5 minutes
1 cycle 8 ℃ for ∞
結(jié)果判斷
PCR擴增的結(jié)果有可能出現(xiàn)以下幾種情況（表2）：
表2. PCR擴增的可能結(jié)果
| 電泳結(jié)果 | 電泳結(jié)果 | 電泳結(jié)果 | 電泳結(jié)果 | 電泳結(jié)果 | 電泳結(jié)果 |
586 bp內(nèi)參條帶 | ++ | - | + | ++ | ++ | - |
270 bp左右條帶 | - | ++++ | +++ | ++ | + | - |
結(jié)果圖示（見圖1） | 泳道1 | 泳道2 | 泳道3 | 泳道4 | 泳道5 | 泳道6 |
支原體污染判斷 | 陰性 | 極重度污染 | 重度污染 | 中度污染 | 輕度污染 | PCR被抑制 |
注：“-”代表沒有條帶；“+”代表有條帶；“+”號越多代表條帶越強。
圖1. 支原體PCR擴增結(jié)果。586 bp條帶為內(nèi)參條帶，270 bp左右的條帶為支原體特異條帶（各支原體的條帶大小會略有不同，總體在260-280 bp）。隨著支原體DNA模板的增加，270 bp左右的條帶會逐漸增強而586 bp的內(nèi)參條帶會逐漸減弱，甚至消失。泳道1：陰性對照或者沒有支原體污染的樣品；泳道2：極重度支原體污染樣品；泳道3：重度污染樣品；泳道4：中度污染樣品；泳道5：輕度污染樣品；泳道6：PCR的擴增被細胞的代謝產(chǎn)物抑制，導(dǎo)致擴增失敗。M：DNA marker.
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